Khả năng chống lại bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm thẻ chân trắng của chiết xuất từ cây Diệp hạ châu

Ngành nuôi tôm Việt Nam đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn và cũng đã trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước. Doanh thu xuất khẩu tôm nước lợ công nghiệp ước đạt 4,2 tỷ USD năm 2019 (DOF, 2019). Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là một trong những đối tượng nuôi cho sản lượng lớn và giá trị kinh tế cao.

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (EMS) ở tôm do vi khuẩn Vibrio sp. gây ra. Bệnh này có thể dẫn đến tỷ lệ chết lên đến 100 % trong môi trường sống của cả tôm thẻ chân trắng (L. vannamei) và tôm sú (Penaeus monodon), gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm.

Dấu hiệu lâm sàng của bệnh bao gồm đường tiêu hóa trống rỗng, bụng trắng đục, gan có đốm trắng, tôm lờ đờ, chán ăn, mềm vỏ (Leano và Mohan, 2012). Bệnh AHPND được chú ý đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2009, sau đó được phát hiện ở một số khu vực khác của Châu Á như: Việt Nam (2010), Malaysia (2011), Thái Lan (2012) và Mexico (2013).

1. Giới thiệu

Tác nhân gây bệnh AHPND/EMS được xác định là chủng Vibrio parahaemolyticus chứa độc tố mã hóa plasmid pVA PirAVp và PirBVp. Cũng theo báo cáo của Giang và cộng sự (2016), đã xác định được 3 chủng vi khuẩn gồm: V. parahaemolyticus; V. alginolyticus và V. vulnificus với tần suất bắt gặp cao nhất trên 60% trong các mẫu tôm bệnh.

Trong đó, kết quả PCR xác định có sự hiện diện của vi khuẩn V. parahaemolyticus được coi là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp . Trong khi đó, kết quả phân tích mới của Jee Eun Han và cộng sự (2017) cho thấy cả 4 chủng Vibrio sp. (16-902/1, 16-903/1, 16-904/1 và 16-Nhân 905/1) đều được phân lập từ dạ dày của tôm bị bệnh hoặc mẫu trầm tích từ các trang trại bị ảnh hưởng bởi AHPND ở Mỹ Latinh trong năm 2016.

Việc xác định vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng trình tự 16S rRNA và xét nghiệm PCR đặc hiệu Vibrio nhắm vào gen hly. Bằng xét nghiệm PCR, 4 chủng này được xác định là V. campbellii bằng phân tích trình tự 16S rRNA và phản ứng PCR gen hly. Các chủng V. campbellii này có cả gen pirAvp và pirBvp.

Theo Linh NQ (2014), chủng V. parahaemolyticus V1 được phân lập từ mẫu tôm giống bệnh EMS tại tỉnh Thừa Thiên Huế với mật độ từ 103 – 10 4 CFU/mL trong thời kỳ ủ bệnh. Theo Citarasu (2010), các loại thảo mộc có đặc tính có lợi như kích thích tăng trưởng, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn và chống nấm).

Nhiều nghiên cứu khác cũng chứng minh, có nhiều loại dược liệu như: lá ổi (Psidium guajava), lá trầu không (Piper betel L.), diệp hạ châu (Phyllanthus amarus), hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) có tác dụng kháng vi khuẩn gây bệnh AHPND ở tôm thẻ chân trắng có V. parahaemolyticus KC12.020; chủng V. parahaemolyticus KC13.14.2 và V. harveyi KC13.17.5.

Cao lá ổi – một trong những thảo dược hiệu quả trong việc hỗ trợ và điều trị bệnh cho gan tôm

Các loại thảo mộc cũng được sử dụng để tạo hương vị, kích thích bài tiết đường tiêu hóa, do đó làm tăng lượng thức ăn ăn vào cũng như giảm tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (Venketramalingam et al, 2007). Bên cạnh đó, không chỉ loài thảo mộc này được nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm thẻ chân trắng (L. vannamei) mà nhiều loài thảo mộc khác cũng được nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm thẻ chân trắng Ấn Độ (Fenneropenaeus indicus), cụ thể: ba kích chiết xuất kháng khuẩn, Psoralea corylifolia, Murraya koenigii và Quercus Indicoria đã ức chế hiệu quả mầm bệnh vi khuẩn ở tôm được phân lập từ ruột F. indicus bị nhiễm bệnh.

Vùng ức chế trung bình được quan sát nằm trong khoảng từ 9,00 đến 14,00 mm đối với các mầm bệnh vi khuẩn được chọn bao gồm các chủng Pseudomanas aeruginosa, Staphylococus aureus và V. harveyi. Một nghiên cứu khác chứng minh rằng sử dụng diệp hạ châu chiết xuất bằng ethanol để làm giàu ấu trùng Artemia tạo ra SR, WG và SGR tốt nhất (tương ứng là 96,6%, 1,01g và 4,1% so với đối chứng là 82%, 0,6g và 3,9%) trong Tôm càng xanh.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Cây thảo dược

Diệp hạ châu được thu hái từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2019 tại vùng núi tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Các cây dược liệu được chọn là những cây đã trưởng thành, có khối lượng trung bình 3,25 g và chiều cao trung bình 28,82 cm.

Các loại diệp hạ châu cần phân biệt rõ

Mẫu phải tươi, không dập nát, có màu xanh lục. Chúng được rửa sạch bằng nước ngọt.

2.2. Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được xác định mang hai gen độc tố PirAVp, PirBVp được phân lập từ các mẫu tôm bệnh (AHPND) tại các trại nuôi tại Thừa Thiên Huế, Việt Nam và dán nhãn. Khối lượng trung bình của các mẫu là 0,36g. Thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm vô trùng (Labcaire VLF-R) thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế.

Chủng vi khuẩn được giữ ở -80℃ và sau đó được phục hồi trong môi trường nuôi cấy tăng sinh, cụ thể là Tryptic Soy Borth (TSB) bổ sung 2% NaCl trong tủ ấm lắc 2 khay (GFL 3032) ở nhiệt độ 37℃, có lắc tần số 180 vòng/phút trong 24 giờ để thu dịch vi khuẩn.

Sau đó, mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) bằng máy quang phổ UV-VIS (U2900, Hitachi, Japan) ở bước sóng 600 nm. Mật độ vi khuẩn được điều chỉnh đến 106 CFU/mL (OD = 1, tương đương mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL) để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn so với mật độ vi khuẩn ban đầu.

2.3. Pha chế kháng sinh

Dịch chiết diệp hạ châu được hòa trong nước cất vô trùng (pha loãng theo tỷ lệ 1g/1 mL) thành các nồng độ 1.000, 750, 500 và 250 mg/mL. Đối chứng âm là nước cất vô trùng.

Dịch chiết diệp hạ châu

Mẫu dịch chiết diệp hạ châu thành phẩm

2.4. Các hoạt động kháng khuẩn của dịch chiết diệp hạ châu

Hoạt tính diệt khuẩn của dịch chiết được kiểm tra bằng thử nghiệm khuếch tán đĩa, còn được gọi là phương pháp Kirby-Bauer. Thử nghiệm được thực hiện trong Labcaire VLF-R vô trùng. Huyền phù chứa chủng vi khuẩn (100 µL, 106 CFU/mL) được phân bố đều trên các đĩa thạch chứa môi trường peptone kiềm đặc.

Đặt đĩa giấy vô trùng (d = 0,6 mm) lên mặt đĩa thạch (gồm 4 mẫu và 1 đối chứng âm tính (nước cất vô trùng). Cho 50 µL dịch chiết thực vật có nồng độ 1.000; 750; 500 và 250 mg/mL vào. đĩa giấy, sau đó bảo quản ở 4℃ trong 8 giờ để dịch chiết dàn đều trên bề mặt đĩa giấy với 4 lần nhắc lại, đo đường kính vùng ức chế sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.

3. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu nhằm xác định hiệu suất dịch chiết (%), hoạt tính kháng khuẩn, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của dịch chiết thực vật từ cây diệp hạ châu khô và tươi đối với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp. (AHPND) trên tôm thẻ chân trắng (L. vannamei).

Kết quả cho thấy, hiệu suất dịch chiết dược liệu khô và tươi lần lượt đạt 11,50% và 2,75% và hoạt tính kháng khuẩn của 2 dịch chiết đều tốt ở nồng độ từ 250 – 1.000 mg/mL với cùng mật độ vi khuẩn 106 CFU/mL. . Cụ thể, đường kính vùng ức chế ở mức 250; 500; 750 và 1.000 mg/mL của dịch chiết dược liệu khô đạt 16,75±0,96; 18,50±1,29; 20,75±0,96 và 21,25±0,50 mm, trong khi đó của dịch chiết dược liệu tươi đạt 14,50±1,29; 16,25±0,50; lần lượt là 16,75±0,50 và 17,00±0,00 mm với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05.

Kết quả cũng cho thấy giá trị MIC của chiết xuất khô và tươi được xác định lần lượt là 125 mg/mL và 250 mg/mL và giá trị MBC của dịch chiết lần lượt là 500 và 1.000 mg/mL. Phân tích GC-MS cho thấy trong dịch chiết khô có 19 hợp chất tự nhiên, trong đó hợp chất Ethyl Linoleolate (C20H36O2) chiếm tỷ lệ cao nhất (22,43 %), còn hợp chất 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methy-4H-pyran -4-one (C6H8O4) thấp nhất (0,24 %).

NGUỒN: công ty Thiên Tuế lược dịch

Công Ty Cổ Phần Dược Phẩm Thiên Tuế

THIENTUE PHARMACEUTICAL JOINT STOCK COMPANY

Xin chào quý khách! Công Ty Cổ Phần Dược Phẩm Thiên Tuế (Thientue Pharma JSC) tự hào là đơn vị cung cấp nguyên liệu dược liệu cho sản xuất Thực phẩm chức năng, Thức ăn chăn nuôi và Thuốc thú y - thủy sản hàng đầu Việt Nam.

Thiên Tuế xin gửi tới Quý khách hàng lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe, may mắn và thành công. Chúng tôi rất mong nhận được sự hài lòng từ quý khách hàng. Xin cám ơn quý khách!

Công Ty Cổ Phần Dược Phẩm Thiên TuếTHIENTUE PHARMACEUTICAL JOINT STOCK COMPANYXin chào quý khách!Công Ty Cổ Phần Dược Phẩm Thiên Tuế (Thientue Pharma JSC) tự hào là đơn vị cung cấp nguyên liệu dược liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi hàng đầu Việt Nam.Thiên Tuế xin gửi tới Quý khách hàng lời chào trân trọng, lời chúc sức khỏe, may mắn và thành công. Chúng tôi rất mong nhận được sự hài lòng từ quý khách hàng.Xin cám ơn quý khách!